1 概述

"慢冻快融"是细胞冻存和复苏的操作原则，其目的是尽可能避免细胞被冰晶所伤。

尽管如此，慢冻的过程也有需要快速操作的环节，快融复苏后也有需要缓慢操作的地方。

我们今天就来解析一下。

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"慢冻快融"的原因：当降温时，细胞内的水分会形成小冰晶，小冰晶又会继续聚集成大冰晶，缓慢降温能让水分有充足时间渗出细胞，避免小冰晶形成大的冰晶刺破细胞膜。复苏时，细胞外的冰晶开始融化成水，水会重新附着在未融化的冰晶上，导致冰晶变大，挤压细胞造成机械损伤，细胞内残留的冰晶同理，因此快速渡过融化阶段，也能尽量降低细胞损伤。

2 慢冻中的“快”

4℃— -20℃ — -80℃，这是传统的冻存降温三步。这三个阶段后就是转移至液氮罐长期储存。

不同实验室的布局不一样，有的样本库所有设备都在一个房间内，打开-80℃拿出样本，转身就能放入液氮罐，但有的竟然相隔一层楼甚至一栋楼。

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“在室温环境下，从冰箱拿出来的冻存管会以10℃/min的速度升温。”先记住这一个信息。

当细胞升温至-50℃至-15℃这个区间时，小冰晶会融化重新冻结在其他冰晶上——重结晶。大量小冰晶聚合就会成为少数巨大的、尖锐冰晶，刺破细胞。

并且，在这个升温区间，细胞内的部分区域开始融化，细胞质溶质浓度升高，时间越长，细胞在高渗透压和高浓度离子下受到的化学毒性就越强。

也就是说，细胞从-80℃转移至液氮罐内要“快”，细胞暴露在室温下的时间不应该超过3分钟，否则就会造成细胞损伤。这就是冻存时要快速操作的地方。

接下来，我们再补充一个小知识。

从下方的降温曲线可见，冻存管从-20℃降温到-50℃区间时，只用了不到20分钟，但-50℃至-60℃却花了30分钟（因图中实验到-60℃后就直接转液氮了，所以并没有降温至-80℃的时间）。

实际上，在-50℃后开始直到-80℃，冻存管的降温速度就开始变得越来越慢了。其本质是随着温度持续降低，样本的温度逐渐接近环境温度时，环境冷源移除样本热量的能力开始变低，形成了一个类似平台期的热平衡阶段，越接近环境温度降温越慢。

因此，要让冻存管降温至-80℃，预留数小时是必要的——这也是为什么冻存管放入-80℃后要过夜再转移的原因。

而我们发现的常见错误有：跳过这一步直接进液氮；赶时间结束实验（比如第二天放假，不来实验室了），放-80℃后一会就转液氮。这种骚操作会带来什么影响呢？

细胞在-80℃待的时间不够，温度未彻底降至-80℃快，那么转移至液氮的安全时间就变短了。

因此，细胞冻存，有条件的应该首选程序降温盒，没条件的则应遵循实验步骤要求分阶段降温，转移细胞时速度越快越好。

3 快融后的”慢”

细胞复苏融化后，需要加入培养基重悬并铺入培养瓶皿内。常见的操作指南会建议加入数倍于冻存体系的培养基，稀释DMSO对细胞的毒性。

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可是，操作指南极少提及在解冻后，添加培养基重悬细胞的操作需要缓慢，培养基应该分次滴入。

这个操作背后的原因涉及渗透压剧烈变化对细胞造成的渗透损伤。

冻存时加入的DMSO会穿透细胞膜进入细胞，在内部形成一个高渗环境，细胞则会通过“失水”皱缩达到内外渗透压平衡。而解冻后加入的培养基，其渗透压远远低于细胞。

一瞬间加入的大量培养基，会形成细胞内外巨大的渗透压差距，大量的水分涌入细胞。就像一个快速吹胀直到被吹破的气球，细胞膜也会被撑破。

合理的操作是，分次+缓慢加入培养基。第一次可以先吸2-3mL，然后逐滴滴入细胞悬液中（细胞悬液应提前转移至离心管内），加完之后轻轻摇晃促进混合。

然后再继续缓慢加入培养基稀释10倍左右。整个稀释过程控制在2分钟左右完成。

稀释后的细胞需要分瓶培养吗？我强烈建议不要分瓶，复苏过程一定会造成细胞死亡，高浓度接种，即便有相当一部分细胞死亡，剩下的细胞贴壁后，也不会因为密度太低而产生生长抑制。

最后，稀释后的细胞悬液是否需要离心？我认为大部分细胞可以不离心，将DMSO稀释10倍以后，次日再通过换液去掉DMSO，细胞仍然是可以存活的。

但有的细胞对DMSO很敏感，例如HL-60、K562、PC12细胞，那就要离心后再种入培养瓶内，离心的条件建议为200-300 x g , 2-3min。

如果你拿不准自己的细胞是否对DMSO敏感，则统一离心后再种入瓶内。

文章出自：实验外实包   想了解更多请关注：http://www.dj-cro.com/