在实验之前，要确定好自己攻菌的MOI（细菌量/细胞量）以及攻菌时间，以及所使用的细胞板或者培养皿。

使用6孔板（可以根据自己的实验条件或者目的选择）进行攻菌！（我最终是要提取细胞的RNA，细胞量要大，所以选用6孔板来做）

1、提前一天进行细胞铺板

1）攻菌时间设置3h、6h、12h ; 细菌MOI 1、0.1、10。

每个时间段使用两个6孔板（共6个孔板），孔板布局如下图所示。

每孔接种细胞量大概在2*106个，每孔加2ml完全培养基。

2）细胞计数

准备2~3个10cm细胞培养皿的细胞（长到大概70%-80%之间）。

弃去原有培养基，用PBS洗2~3遍，加入1ml胰酶消化2~3分钟（37°培养箱内消化），1ml培养基终止消化。

吹打细胞，使其全部脱落，吸至15ml离心管内。

1000rpm离心5min（离心机一定要配平！！！），弃上清，取1ml培养基混匀细胞。

取90ul的细胞悬液加入10ul的台盼蓝混匀，放置2~3min后，吸取10ul到血球计数板上计数。

分别计数大方格1.2.4.5中的细胞数。　计数原则为：“数上不数下，数左不数右”。(判断标准为是否接触三条边线的中间线，如下图所示)

N(每毫升样品中细胞的个数 )= 每个大方格内细胞的平均数 × 细胞稀释倍数×104

3）计算每孔需要加多少的细胞量

V（每孔需要的细胞悬液量 ml）=2*106个/N个/ml

确保细胞量足够。

加完一个细胞板后，用十字振荡混匀后再放入培养箱培养。

2、提前9h挑单菌摇菌

从平板中挑取单菌落，放在10mlTSB培养基中。摇床设置37℃、180rpm（提前打开），振荡培养过夜。

根据之前我所做的实验，在振荡培养9h后细菌仍处于对数生长期，并且细菌数大概是8*107CFU/ml。

3、细胞攻菌

取出菌液（如果不确定细菌数，可以测OD值来计算）。

计算每孔需要接种的菌液量：V/v(菌液量）；再计算出不同MOI所需的菌液总量。

准备三个50ml离心管，标记好MOI，加入培养基总量和与之对应的菌液总量。

取出我们前一天铺的细胞板，弃原有培养基，用PBS洗两遍，加入相对应的培养基（含菌液）。

将其放入培养箱内继续培养相对应的时间，在不同的时间段取出相对应的细胞板提取RNA。

文章出自：细胞实验外包   想了解更多请关注：http://www.dj-cro.com/